퀴논화합물 유도체들의 생리활성과 면역증강에 대한 효 과는 오래 전부터 문헌에 보고되고 있으며(Szent-Györgyi, 1972; Szent-Györgyi, 1982; Huang et al., 1985; Hidvégi et al., 1999), Fig. 1에 표시된 2-methoxy-1,4-benzoquinone(2- MBQ) 및 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone(2,6-DMBQ)은 세 균, 곰팡이에 대한 생육 저해효과를 나타내며, 악성 종양 세포에 대하여 세포 독성을 나타낸다고 보고되었다(Lana et al., 2006). 이 두 화합물은 밀배아에서 배당체 형태로 존재하는 것으로 보고되었으며(Szent-Györgyi, 1972), 특히 2,6-DMBQ는 다양한 식물의 조직에 존재하고 이 중 음식 으로 섭취되는 것으로는 국화과에 속하는 양상추나 꽃상추, 홍화 등이 있으며 콩과의 대두, 완두와 렌즈콩 등이 있으며 곡물, 블루베리 등이 있다(Handa et al., 1983). 주요 곡주요 곡물에 함유된 2,6-DMBQ의 함량을 살펴보면 밀배 아는 0.1 mg/g, 발효된 밀배아에는 0.2 mg/g, 발아된 밀에 는 0.001 mg/g, 보리 배아에는 0.07 mg/g 정도 함유되어 있 는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Daood, 2004). 현재 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 밀 배아 발효물이 개발되어 아베마르(FWGE )라는 제품으로 전세계적으로 판매되고 있으며 0.4 mg/g의 농도로 2,6- DMBQ를 함유하는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Hidvégi, 1996; Hidvégi et al., 1998; Tömösközi-Farkas et al., 1998). 효모를 이용한 밀배아 발효물의 효능은 암세포의 MHC- Ⅰ분자의 합성을 감소시킴으로써 암세포가 NK세포에 의해 공격받아 파괴되도록 유도하며(Fajka-Boja et al., 2002), 물에 함유된 2,6-DMBQ의 함량을 살펴보면 밀배 아는 0.1 mg/g, 발효된 밀배아에는 0.2 mg/g, 발아된 밀에 는 0.001 mg/g, 보리 배아에는 0.07 mg/g 정도 함유되어 있 는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Daood, 2004). 현재 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 밀 배아 발효물이 개발되어 아베마르(FWGE )라는 제품으로 전세계적으로 판매되고 있으며 0.4 mg/g의 농도로 2,6- DMBQ를 함유하는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Hidvégi, 1996; Hidvégi et al., 1998; Tömösközi-Farkas et al., 1998). 효모를 이용한 밀배아 발효물의 효능은 암세포의 MHC- Ⅰ분자의 합성을 감소시킴으로써 암세포가 NK세포에 의해 공격받아 파괴되도록 유도하며(Fajka-Boja et al., 2002), 

퀴논화합물 유도체들의 생리활성과 면역증강에 대한 효 과는 오래 전부터 문헌에 보고되고 있으며(Szent-Györgyi, 1972; Szent-Györgyi, 1982; Huang et al., 1985; Hidvégi et al., 1999), Fig. 1에 표시된 2-methoxy-1,4-benzoquinone(2- MBQ) 및 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone(2,6-DMBQ)은 세 균, 곰팡이에 대한 생육 저해효과를 나타내며, 악성 종양 세포에 대하여 세포 독성을 나타낸다고 보고되었다(Lana et al., 2006). 이 두 화합물은 밀배아에서 배당체 형태로 존재하는 것으로 보고되었으며(Szent-Györgyi, 1972), 특히 2,6-DMBQ는 다양한 식물의 조직에 존재하고 이 중 음식 으로 섭취되는 것으로는 국화과에 속하는 양상추나 꽃상추, 홍화 등이 있으며 콩과의 대두, 완두와 렌즈콩 등이 있으며 곡물, 블루베리 등이 있다(Handa et al., 1983). 주요 곡주요 곡물에 함유된 2,6-DMBQ의 함량을 살펴보면 밀배 아는 0.1 mg/g, 발효된 밀배아에는 0.2 mg/g, 발아된 밀에 는 0.001 mg/g, 보리 배아에는 0.07 mg/g 정도 함유되어 있 는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Daood, 2004). 현재 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 밀 배아 발효물이 개발되어 아베마르(FWGE )라는 제품으로 전세계적으로 판매되고 있으며 0.4 mg/g의 농도로 2,6- DMBQ를 함유하는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Hidvégi, 1996; Hidvégi et al., 1998; Tömösközi-Farkas et al., 1998). 효모를 이용한 밀배아 발효물의 효능은 암세포의 MHC- Ⅰ분자의 합성을 감소시킴으로써 암세포가 NK세포에 의해 공격받아 파괴되도록 유도하며(Fajka-Boja et al., 2002), 물에 함유된 2,6-DMBQ의 함량을 살펴보면 밀배 아는 0.1 mg/g, 발효된 밀배아에는 0.2 mg/g, 발아된 밀에 는 0.001 mg/g, 보리 배아에는 0.07 mg/g 정도 함유되어 있 는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Daood, 2004). 현재 효모인 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 밀 배아 발효물이 개발되어 아베마르(FWGE )라는 제품으로 전세계적으로 판매되고 있으며 0.4 mg/g의 농도로 2,6- DMBQ를 함유하는 것으로 알려져 있다(Tömösközi-Farkas & Hidvégi, 1996; Hidvégi et al., 1998; Tömösközi-Farkas et al., 1998). 효모를 이용한 밀배아 발효물의 효능은 암세포의 MHC- Ⅰ분자의 합성을 감소시킴으로써 암세포가 NK세포에 의해 공격받아 파괴되도록 유도하며(Fajka-Boja et al., 2002), 

직 간접적으로 암세포를 공격하는 TNF-α가 생산되고 이것에 의해 유도된 ICAM-1은 백혈구가 암세포에 도달하는 것을 촉진시키며(Telekes et al., 2005), 암세포의 포도당 대사에 영향을 주는 것 등이 보고된 바 있다(Comin-Anduix et al., 2002; Telekes et al., 2009). 밀배아는 밀(Triticum vulgare) 을 도정할 때 발생하는 부산물로서 밀의 약 2-4%(w/w)를 차지하며, 비타민 E를 비롯한 비타민 복합체가 풍부한 것 으로 알려져 있다(Heimbach et al., 2007). 이러한 밀배아에 는 2,6-DMBQ가 배당체 형태로 존재하는 것으로 알려져 있는데 발효에 관여하는 효모가 생산하는 β-glucosidase의 작용에 의하여 비배당체로 유리된다고 보고되었다(SzentGyörgyi, 1982). β-Glucosidase(β-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) 는 이당류나 다당류 또는 당쇄결합물의 β-1,4 결합을 주로 절단하는 효소로서 생체 내에서 중요한 역할을 담당하고 있다(Baldrian & Valá∨ sková , 2008). Bifidobacterium sp. 및 Lactobacillus sp. 등의 미생물이 보유하고 있는 βglucosidase를 생산하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이 소플라본으로 전환시켜 소화 흡수율을 증진시킨 연구결과 가 보고된 바 있다(Champagne et al., 2010; Donkor & Shah, 2007). Decroos et al.(2005)은 Lb. mucosae, Enterococcus faecium, Finegoldia magna, Veillonella sp. 균주의 혼합배 양에 의해서 daidzein이 equol으로 생물전환이 되는 반면, 단독배양에서는 daizein이 equol이나 dihydrodaidzein으로 생물전환되지 않는다는 것을 보고하였다. 그밖에 β-glucosdiase 활성이 높은 젖산균이나 효모를 스 타터로 사용하여 대두유를 발효하여 생리 활성이 높은 이소 플라본의 생성을 촉진하는 연구가 수행되었으며(Pyo et al., 2005; Yu et al., 1987; Yu et al., 1988), β-glucosidase 활성 을 나타내는 Bifidobacteria와 Lactobacillus를 이용하여 anthocyanin의 당쇄결합을 분해함으로써 생리 활성을 나타 내는 malvidin과 활성형의 페놀산을 얻은 연구도 보고된 바 있다(Ávila et al., 2009). 또한 인삼 재배 토양으로부터 βglucosidase 생산 능력을 지닌 미생물을 분리하여 ginseno side Rb1 을 약리활성을 지닌 ginsenoside Rd로 전환시킨 연 구결과가 보고되었다(Kim et al., 2005).

 본 연구에서는 비배당체인 2,6-DMBQ 및 2-MBQ를 생 산하기 위하여 필요한 β-glucosidase 활성이 높은 효모와 젖산균을 선발하여, 밀배아 발효에 이용하고자 하였다. 재료및방법 밀배아 밀배아는 (주)동아원(Seoul, Korea)에서 구입하여 -80o C 에 보관하면서 사용하였고 발효 기질로 사용하기 전에 가 정용 분쇄기(FM-909T, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 30초간 분쇄하였다. 균주 및 발효조건 우유를 비롯한 식품으로부터 분리된 효모 및 Lactobacillus 젖산균은 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (The Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 구입하였다. 효모를 배양하기 위하여 YEPD배 지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)를 사용하였 으며 젖산균은 MRS배지(BD Diagnostic Systems, SPARKS, MD, USA)를 사용하였다. β-Glucosidase 효소생성 유도용 배지는 YEPD와 MRS배지에 함유된 탄소원인 포도당을 2% 농도의 

발효가 완료되면 원심분리 (16,110 ×g, 10 min)하여 상등액을 취하여 0.45 µm 여과지 (Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하고 동결건조(Ilshin Engineering Co., Seoul, Korea)한 후 -80o C에 보관하였다. 세포외 β-glucosidase 활성 측정 β-Glucosidase 효소활성은 Hong et al.(2009)의 방법을 일 부 변형하여 수행하였다. 세포가 제거된 상등액을 조효소액 으로 이용하였고, p-nitrophenol 용액(Sigma-Aldrich)을 여러 농도로 희석한 뒤 410 nm에서의 흡광도를 측정하여 검량선 을 작성하였다. 기질은 sodium acetate 완충액(500 mM, pH 4.5)에 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG, SigmaAldrich)의 농도가 33 mM이 되도록 용해시킨 후, 16 µL의 조효소액에 기질용액을 48 µL 첨가하여 30o C에서 30분 동 안 반응시켰다. 효소반응은 136 µL의 1 M Na2CO3(Duksan, Ansan, Korea)를 주입하여 종결시켰다. 생성된 p-nitrophenol 농도는 410 nm에서 흡광도를 측정하고 미리 구한 검량선을 이용하여 결정하였다. 1 unit의 효소활성은 30o C, pH 4.5 조 건에서 1분 동안 1 µmole의 p-nitrophenol을 생성하는 효소 의 양으로 정의하였다. 단백질 정량 Bradford Dye Reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 제조사가 제시한 조건에서 단백질 농도를 측정하 였으며, 적정농도로 희석된 bovine serum albumin(BSA, Bio-Rad)을 이용하여 표준선을 작성하였다. 2-MBQ 및 2,6-DMBQ 정량 분석 밀배아 발효물 중의 2-MBQ 및 2,6-DMBQ의 함량은 Tömösközi-Farkas & Daood(2004)의 방법을 변형하여 측정 하였다. 동결건조물 1g을 증류수 50 mL에 용해시킨 후 100 mL의 클로로포름(SK Chemical, Ulsan, Korea)을 이용 하여 3회 분획하였다. 분획물을 감압 농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40o C에서 농축하여 고형분을 얻 은 후 20 mL의 HPLC(high-pressure liquid chromatography) 이동상(25 mM KH2PO4:acetonitrile = 9:1, pH 4.8)으로 용해 시키고 0.45 µm 주사기형 여과지(Minisart RC4, Sartorius Stedim Biotec GmbH, Goettingen, Germany)로 여과한 후 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 분석 하였다. 분석용 컬럼은 RP-Amide C16(250×4.6 mm, Supelco Inc.,